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Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞

（一）　原理

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。

二）操作方法及注意事項(xiàng)
　　1.不同濃度（密度）Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。
　Percoll濃度（％）　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20
　　比重g／ml　　　  1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
    3.裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度也不可過高，否則會影響細(xì)胞的分離和回收。
    4.離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。
    5.取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。
　　（三）分離純化細(xì)胞舉例
　　1.富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL）的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管（或塑料管）分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
    2.純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層Percoll之間為淋巴母細(xì)胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

（四）　人不同血細(xì)胞的漂浮密度
　　　　　　　　　　表　　　人不同血細(xì)胞的漂浮密度
　　　──────────────┬──────────────────
　　　細(xì)　胞　　　漂浮密度　　　　│ 細(xì)　胞　　　　　　　漂浮密度
　　　──────────────┼──────────────────
　　　紅細(xì)胞　　1.09-1.11　　　 　│淋巴細(xì)胞　　　　　　　1.052-1.077
　　　粒細(xì)胞　　　　　　　　　　  │ B淋巴細(xì)胞　　　　　 1.062-1.075
　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　  │ T淋巴細(xì)胞　　　　　 1.065-1.077
　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　 │ 淋巴母細(xì)胞　　　　　1.065-1.077
　　　單核細(xì)胞　1.050-1.066　　　 │自然殺傷細(xì)胞　　　　　1.050-1.070
　　　血小板　　1.030-1.060　　　 │
　　　──────────────┴──────────────────

（五）問與答　
問：請問percoll連續(xù)梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續(xù)梯度?
答：根據(jù)你需要的具體密度梯度決定的，根據(jù)要分離的不同細(xì)胞種類，數(shù)量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細(xì)胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg
Percoll濃度（％）  70     60      50      40      30       20
比重g／ml      1.090  1.077    1.067   1.056   1.043    1.031